食用菌菌種保藏歷史、現狀及研究進展概述*

孔維麗，袁瑞奇，孔維威，張玉亭**，康源春，韓玉娥
（河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所，河南 鄭州 450002）
《中國食用菌》2015.5

　　摘要：從微生物菌種保藏的歷史出發，簡要介紹食用菌菌種現狀、保藏現狀、保藏任務等，重點介紹了食用菌菌株不同保藏方法的應用及研究進展，供廣大讀者參考借鑒。
　　關鍵詞：食用菌；保藏；研究進展

　　世界各國非常重視微生物菌種的保藏工作，最早的菌種保藏工作從1890年開始，但直到1906年，各國才相繼建立了菌種保藏機構。中國的菌種保藏機構始建于20世紀50年代，直到1979年正式成立6個專業性保藏管理中心[1]。隨著食用菌產業的快速發展，中國已經成為世界食用菌種植和出口最大的國家之一，越來越重視對食用菌種質資源的收集與保藏工作。
　　1 菌種保藏技術的發展歷史
　　微生物菌種資源保藏機構緣起歐洲，1890年捷克微生物學家F ran-tisek Kral 最早開始從事微生物菌種的公共性保藏[1]。菌種保藏的發展經歷了兩個大的階段：微生物菌種保藏機構的興起建設階段和發展壯大階段。20世紀初在巴黎、比利時、倫敦和日本等有關研究所相繼建立了幾個菌種保藏機構，延續至今的有1906年在荷蘭建立的CBS（Centralbureau voor Schim-melcultures），1925年在美國建立的A TCC（America Type Culture Collection）。我國的菌種保藏機構始建于20世紀50年代。1979年在原國家科委的組織領導下，召開了第一屆全國菌種保藏會議，成立了中國微生物菌種保藏管理委員會，正式建立了6個專業性保藏管理中心[1]。1963年國際微生物學會協會（International Association of Microbiology Societies）在渥太華召開國際菌種保藏會議，成立了“菌種保藏分會”（Section on Culture Collection)。1970年，在墨西哥城舉行的國際微生物學會議上，將菌種保藏分會改組為世界菌種保藏聯合會（World Federation for Culture Collections，簡稱WFCC），同時確定澳大利亞昆士蘭大學微生物系為世界資料中心。WFCC成立之后，菌種保藏機構進入有序管理階段，WFCC每3年～4年召開一次國際菌種保藏大會。該組織目前擁有601個保藏單位成員，分布在68個國家和地區。2004年～2010年第十屆、第十一屆、第十二屆國際菌種保藏會議分別在日本、德國、巴西召開。2013年第十三屆國際菌種保藏會議在北京召開，標志著我國菌種保藏技術手段達到世界領先水平。
　　2 國內食用菌菌種保藏現狀
　　2.1 國內食用菌菌種現狀
　　2.1.1 種植品種多、范圍廣
　　我國是世界上人工栽培食用菌最早的國家，食用菌種類繁多，野生食用菌數量超過2000種，馴化后的種類超過100種，商品化的種類超過60種。從1980年開始食用菌種植走向快速發展階段，經過近30年大的發展已經逐步形成了不同特色區域：南方福建銀耳、雙孢蘑菇栽培，上海工廠化金針菇、真姬菇栽培，浙江香菇、雙孢蘑菇等栽培；北方黑、吉、遼地區的黑木耳、滑子菇等栽培；中部地區山東、河南、河北、湖北、安徽的平菇、雙孢蘑菇、香菇、毛木耳等栽培。中國食用菌種植規模和產量已經成為世界最大的國家之一，據2012年中國食用菌產業發展大會資料介紹，中國食用菌產量占到全球總產量70%以上，排名世界第一。
　　2.1.2 品種亂
　　實際生產中由于手工栽培者的不規范引用、自繁、代繁、串種，導致品種隨意冠名，國內很多地方出現同物異名和同名異物現象，菌種質量下降，嚴重影響種植者的經濟效益，成為制約我國食用菌產業發展的重要瓶頸問題。
　　2.1.3 逐步走向規范化
　　在各級政府、食用菌科技工作者的共同努力下，食用菌生產逐步向規范化方向發展。2006年，農業部頒布食用菌菌種管理辦法，規范了食用菌菌種的種質資源、良種選育、生產與流通、質量與監督等的要求與管理[2]。在菌種保藏方面國內也逐步建立了知名的食用菌菌種保藏中心：中國農業微生物保藏中心食用菌分中心（上海市農業科學院）、農業部微生物肥料和食用菌菌種質檢中心建立的國家食用菌標準菌株庫（China Center for Mushroom Spawn Standards and Contorl，CCMSSC，掛靠中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，是農業部認定的食用菌菌種保藏機構）、福建農林大學菌物中心（福建農林大學）、中國西南野生生物種質資源庫（中國科學院昆明植物研究所）、福建三明真菌研究所、黑龍江省科學院微生物研究所食用菌研究中心（黑龍江省科學院微生物研究所）等。2002年起省級的菌種保藏中心也開始逐步建立：2002年山東省成立了食用菌菌種保藏中心，2010年河南省成立了食用菌菌種保藏中心。
　　2.2 菌種保藏的重要性
　　2013年WFCC第十三屆國際會議在北京召開[3]，中國科學院微生物研究所東秀珠說：“在微生物領域，不管是基礎科研工作還是生物技術的應用研究，都需要保證菌種的質量和活力，這只有專業的菌種保藏中心才能做到；同時，保藏中心還要保持公益性，保證這些人類共有的財產能為所有人共享。此外，我們還要研究挖掘微生物的應用價值，讓其不斷“升值”，支撐起生物技術發展的源頭。”
　　2.3 菌種保藏的任務
　　菌種保藏主要任務有4個方面：廣泛收集在科學研究與生產中有價值的菌和菌株；研究生物學特性；研究和采取妥善的保藏方法，使菌種（株）不死，不污染，并盡可能少發生變異；編制菌種目錄，為掌握和利用微生物資源提供依據。
　　3 食用菌菌種保藏方法研究進展
　　食用菌菌種的保藏方式總體分為2種：菌絲保藏法和孢子保藏法。菌絲保藏法在生產中最為常用，常見的有定期移植法、礦油封藏法、擔子菌菌絲體液體保藏法、液態氮超低溫凍結法、木屑保藏菌種、廄肥保藏蘑菇菌種、木塊保藏法、枝條保藏法、甘油低溫保藏法、麥粒保藏法。孢子保藏法因其方法相對復雜在生產中受到局限。孢子保藏法主要有沙土管法、L-干燥法、擔孢子濾紙保藏法、冷凍真空干燥法。
　　3.1 定期移植法
　　定期移植法也叫繼代保藏法。將保藏菌株接種于所要求的培養基上，在最適溫度培養至成熟或產生孢子時，置入5℃的冰箱（或冷庫）保存。在培養和保存的過程中，由于代謝產物的累積而改變了原菌的生活條件，結果菌落群體中的個體就不斷衰老和死亡，因此每5天～15天或1個月～4個月重新移植一次，具體間隔時間因種而異。定期移植法適用于所有的食用菌，也是國內外保藏機構最常使用的方法。
　　國內很多學者認為定期移植法培養易造成菌種退化，多用組織分離進行菌種復壯，保持原有的性狀；而日本人認為從菇體中分離的菌株已不同于原菌株[4]。日本使用定期移植法保藏菌株20多年尚未見到菌種退化現象。肖奎等[5]利用I SSR分子技術實時監測、探索杏鮑菇繼代保藏的極限時間，發現杏鮑菇4℃斜面保藏期限為180d，超過180d后杏鮑菇總產量和優菇率明顯下降，因此杏鮑菇的保藏期限最好是3個月。不同菇類是否有不同的保藏期限，值得探討研究。
　　優點：適用于所有的食用菌，方法簡單，設備價格低。缺點：需要經常轉擴，工作量大，在轉擴過程中存在不同菌株易發生混亂的風險。
　　3.2 礦油保藏法
　　礦油保藏法是法國人L umiere1914年發明，世界范圍內廣泛采用[4]。荷蘭的C BS、日本采用此法保藏菌株。礦油保藏期限可在10年以上，一般為5年～7年。李鐘慶等[6]用礦油保藏44屬63種181株菌株，保藏期5年～8年；只有靈芝屬3株、草地蘑菇8株保存5年～6年后失去活力，其余均保持活力。并對12株進行栽培試驗，除假蜜環菌、香菇、銀耳外，其余均保持形成子實體的性狀。方法是液體石蠟高壓滅菌1.5h，40℃恒溫箱蒸發水分備用；PDA斜面培養基長滿試管后，加入滅過菌的液體石蠟，高出斜面1cm為宜，豎直存放于陰涼干燥處。
　　優點：操作簡單，保存時間較長，省工，不需要設備。缺點：菌種需要垂直放置，占地面積大，運輸不便，時間較長時面塞易沾染灰塵，污染。
　　3.3 菌絲液體保藏法
　　1939年Castellani[7]首次報道病原真菌蒸餾水保存技術（preservation in distilled water）后，該技術被廣泛使用。劉風春等[8]用營養液（馬鈴薯20%、葡萄糖20%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%，硫酸銨微量，每支試管5mL）保存了36株擔子菌，保存33個月和42個月后，經過培養試驗表明，保藏33個月后，菌絲球存活率89.2%，菌塊存活率91.9%，42個月后菌絲球存活率83.9%，菌塊存活率88.9%，高于生鹽水的存活水平（生理鹽水33個月的存活率為70%），且此方法不影響子實體的結實能力。楊慧等[9]用蒸餾水保藏金針菇菌株12年，與液氮長期保藏的金針菇0188W、0188N菌株相比較，兩者菌絲生長速度、生長勢、纖維素酶活力差異不顯著，而前者的菌絲滿瓶時間和產量極顯著高于后者。楊慧等[10]用蒸餾水保藏香菇菌株0338和0432發現：2種方法保藏的香菇0338菌絲生長速度無顯著性差異，液氮保藏香菇菌種0432的菌絲生長速度顯著地快于蒸餾水保藏方法保藏的菌種。方法是采用平板或三角瓶培養菌絲至長滿，用打孔器在平板上打孔，取出5塊～6塊菌塊或5個～6個菌球放入到試管內，加入滅過菌的蒸餾水、生理鹽水或營養液，膠塞封口并蠟封。
　　優點：操作簡單，保存時間長，節省用工。缺點是：保藏試管需要直立擺放，空間利用率低。
　　3.4 液氮超低溫保藏法
　　液氮保藏法是將保存的菌株密封于凍存管內，加入合適的冷凍保護劑，經預冷后，放入-196℃液氮罐內，達到長期保存的目的。液氮保藏適合保存各種微生物，同時國外制種商將其列為防止主要珍貴品種丟失的一項保險措施。液氮保藏菌株已經被世界各個保藏機構所采用，而對于其保藏效果的影響因素有不同看法：顧金剛等[11]認為降溫速率控制、復活物快速升到最適溫度、保護劑種類與濃度是液氮保藏技術的3個關鍵環節；韓芹芹[12]報道在液氮保藏過程中，保護劑和解凍方式對平菇菌株影響大于降溫速度。劉新銳[13]認為降溫速率、保護劑濃度、解凍速度、菌株菌齡、保藏基質均對保藏效果有影響。綜上可以看出，液氮保藏法中保護劑在保存過程中是不可缺少的，降溫速率以慢速降溫較好，解凍溫度在35℃～40℃之間，此外，出發菌株培養基的選擇、菌株菌齡、保護劑種類的開發是今后研究方向。
　　優點：此法保藏菌株時間長，可以長達5年～8年，不易退化。缺點：操作稍復雜，需要購買專用設備，定期加液氮，費用相對較高。
　　3.5 木屑、木塊、枝條保藏法
　　木屑保藏法是最原始的保藏方式，同時也是生產中保藏木腐菌最有效的方法。木塊保藏法是在木屑保藏的基礎上有所改進。枝條保藏法是把保藏用的木塊換成了枝條。霍紅[14]報道利用木屑法保藏蜜環菌，可保藏1年～2年。戴曉東等[15]用木屑保藏法分別保藏黑木耳、榆黃蘑、猴頭、滑菇、靈芝，10年后黑木耳菌株依然存活。方法是闊葉樹木屑78%、麥麩20%、蔗糖1%、石膏1%，加水拌勻，分裝于18mm×180mm試管內，至管內3/4處，高壓滅菌40min備用。接種后28℃～30℃培養，當菌絲長至培養料的1/3，終止培養，用石蠟封口，防潮紙包好，4℃保藏1y～2y。啟用時，將冰箱內取出試管放在8℃恒溫箱中活化12h～24h，去掉表面老化菌絲，挑去木屑內新鮮菌絲接種即可。木塊保藏法是選取黃豆粒大小木塊，在1%糖水中內浸泡2h，然后按照木塊80%、木屑20%比例混合培養料，使含水量達到60%，裝入試管內，經高壓滅菌接種。菌絲長滿后，用石蠟封口，放置低溫處保存。張雪岳[16]研究了枝條菌種保藏法，發現其適用于各種木生菌。何云松[16]研究報道了枝條法保藏紅托竹蓀，保藏期4年，菌株生長良好。方法是：在容器內（試管或者三角瓶）放入的木屑培養基，然后放枝條（枝條先浸泡），再加蓋木屑培養基，蓋過枝條頂部0.5cm，高壓滅菌2h，冷卻后接種，菌絲長滿后，放在4℃或自然溫度保藏，啟用時，取出枝條，剝去樹皮，將木塊切成小塊接種。
　　優點：此法簡單容易操作，省時省工。缺點是：占用地方大，只適合保藏木生菌，時間有限。
　　3.6 甘油低溫保藏法
　　甘油低溫保藏法的保藏溫度介于普通冰箱與液氮保藏溫度之間，保藏溫度在-20℃～-70℃之間。阮秋菊[17]研究了在-70℃超低溫冰箱保藏的5個金針菇菌種，以甘油作保護劑，保藏期為2年，結果顯示在-70℃低溫冰箱保藏2年后，菌種沒有發生基因的變異，此報道只對金針菇有效，對其他菌株沒有研究，因此在生產中還需進一步研究。
　　優點：操作簡單。缺點：保藏期限不確定。
　　3.7 孢子保藏法
　　孢子保藏由于其操作復雜，在生產中應用較少，科研機構應用較多，常見的有真空冷凍干燥法、擔孢子濾紙保藏法。
　　3.7.1 真空冷凍干燥法
　　李造成[18]于1985年用此法保藏蘑菇孢子，在自然室溫下，經過23個月，蘑菇存活率沒有下降，經出菇試驗，子實體性狀沒有改變。方蘇等[19]研究了凍干法保藏冬蟲夏草，結果發現蟲草菌種以脫脂牛奶為保護劑，4℃預冷30min，然后于-20℃預凍2h，再于-80℃預凍24h的降溫條件下，凍干機真空干燥后4℃保藏545d，菌株活化萌發長勢好，5L生物反應器培養菌絲得率及主要有效成分蟲草多糖、蟲草酸含量均高于其他保藏方法。
　　優點：保存時間長，不易退化，容易儲存盒出售。缺點：操作復雜，需要專業設備。
　　3.7.2 擔孢子濾紙保藏法
　　在第七屆國際蘑菇科學會議上，T.W.Sinden在1932年收集的雙孢蘑菇孢子保藏在濾紙片上，1968年檢查，竟然存活，保藏期長達36年[4]。方法是濾紙剪成（2～3）cm×（0.5～0.8）cm的長條，平鋪在培養皿內高壓滅菌30min于烘箱內烘干，在試管內放變色硅膠1粒～2粒，加棉塞高壓滅菌，80℃烘干1h，培養皿放置在孢子彈射器內，子實體八成熟，22℃～25℃培養1d～2d，孢子落在無菌濾紙上，濾紙放入小試管內，試管融封，置于1℃～3℃可以長期的保藏。
　　優點：用此法保藏食用菌孢子，保藏時間長，便于運輸。缺點：操作復雜，需要專用設備。
　　4 食用菌菌種保藏效果評價方法
　　對各保藏方法的保藏效果應從不同的角度進行綜合評價。張金霞[21]分別從菌絲形態、菌絲生長速度、可溶性蛋白酶帶、出菇等方面對草菇菌株的保藏效果進行了綜合評價。蔡令儀等[22]從保藏方式對產量的影響方面進行試驗研究。肖奎等[5]利用ISSR技術方法檢測金針菇菌株保藏過程中菌株DNA圖譜的變化。韓芹芹[12]報道了液氮保藏菌種對平菇菌絲體和子實體的影響。綜合以上分析，食用菌菌種保藏效果的評價方法應該從微觀形態和直觀形態兩個方面進行。直觀形態包括：菌株的成活率、接種物存活率、菌落形態特征、產菇能力、子實體性狀、生物學效率等。微觀形態包括：酯酶同工酶譜和可溶性蛋白帶的變化、DAN檢測、菌絲、菌落形態（正常的菌絲一般具有透明、分枝狀、有橫隔和明顯的鎖狀聯合。僅有單核菌絲，不具結實性異宗結合的食用菌不宜作菌種；鎖狀聯合多且密的雙核菌絲結菇力強，一般是好菌種。在適宜的條件下，若菌絲長速正常、粗壯、濃密、整齊，一般為優質菌種）、相關酶活的測定（纖維素酶、漆酶等）、發酵產物的變化（蟲草素、蟲草多糖、香菇多糖等）等方面。

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　　*基金項目：河南省現代農業產業技術體系（S2013-09）；國家自然科學基金（31201670）；河南省自主創新基金（2013JC20）；河南省農業科學院科研發展專項（20137914）；河南省科研開放合作項目（14216000055）。
　　作者簡介：孔維麗（1976-），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌栽培保藏技術研究工作。E-mail:kongweili2005@126.com
　　**通信作者：張玉亭（1964-），男，碩士，研究員，主要從事食用菌栽培產業開發研究工作。E-mail:kyc_2725@163.com