我國靈芝種質資源及生產技術研究進展

李欽艷1，鐘瑩瑩1，陳逸湘1，周衛雄1，曾振基1，宋斌2**
（1.梅州市微生物研究所；2.廣東省微生物研究所省部共建華南應用微生物國家重點實驗室廣東省菌種保藏與應用重點實驗室廣東省微生物應用新技術公共實驗室）
《中國食用菌》 2016年第1期

　　靈芝在中國的記載已超過2000年的歷史，被歷代醫藥學家認為是滋補強壯、扶正固本的“仙草”、“瑞草”，是中國食（藥）用菌研究領域的熱點之一。近年來，靈芝栽培技術、深加工技術得到了快速發展，其市場規模也有了較大發展。據統計，2012年世界靈芝產品的年產值就已超過25億美元，靈芝產業已成為我國最重要的食（藥）用菌產業。目前，市場上靈芝產品的原料來源主要有3種：液體深層發酵產生的菌絲體或發酵產物、靈芝固體發酵的菌質或產物以及靈芝子實體、孢子粉等。本文對中國靈芝種質資源、靈芝發酵技術、靈芝栽培技術進行了簡要概述，并闡述了實施靈芝良好農業規范（GAP）生產的必要性。
　　1 我國靈芝種質資源
　　對我國靈芝的研究始于20世紀初Patouillard報道的采自中國貴州的Ganodermalucidum。至今，中國已發現靈芝科4個屬103種，占世界已知靈芝科種類的88%。我國靈芝的成功栽培最早始于20世紀60年代，中國科學院微生物研究所以青島的靈芝（定名為G.lucidum）分離栽培獲得成功。目前文獻記載的可栽培或有利用價值的靈芝種類有皺蓋假芝（Amaurodermarude）、擬鹿角靈芝（G.am－boinense）、樹舌靈芝（G.applanatum）、狹長孢靈芝（G.boninense）、布朗靈芝（G.brownii）、薄蓋靈芝（G.capense）、硬孔靈芝（G.duropora）、有柄靈芝（G.gibbosum）、桂南靈芝（G.guinanense）、層迭靈芝（G.lobatum）、靈芝（G.lucidum）、無柄靈芝（G.resinaceum）、紫芝（G.sinense）、密紋薄靈芝（G.tenue）、熱帶靈芝（G.tropicum）、松杉靈芝（G.tsugae）等。但市場上的靈芝或者靈芝產品主要是赤芝[G．lucidum(Curtis:Fr.)P.Karst]、紫芝和松杉靈芝，以及以其為主要原料的靈芝產品，在《中國藥典》（2010版）上已有其記載。
　　中國靈芝的栽培種類比較混亂，缺少統一標準的命名規范。已有研究表明，過去曾認為是G.lu－cidum且廣泛分布和栽培、具有重要藥用價值的靈芝，其科學名稱應是中國獨有的種類G.lingzhiS.H.Wu,Y.Cao&Y.C.Dai[12]或者為四川靈芝[G.sichua－nenseJ.D.Zhao&X.Q.Zhang（1983）]。而G.lu－cidum是溫帶種類，其中文名稱應為亮蓋靈芝（俗稱白肉靈芝或白靈芝）。羅聯忠等[16]對23株靈芝栽培菌種進行了DNA指紋鑒別，有效鑒別了大部分靈芝栽培菌種。張勁松等對收集的156個中國栽培靈芝菌株進行了形態學結合分子生物學方法的綜合分析，把它們分成了7個種，并建立了靈芝不同種快速特異性PCR鑒定的方法。由農作和品種審定規范（NY/T1844-2010）認定的靈芝菌種只有“國品認菌2007044金地靈芝”、“國品認菌2007045川芝6號”、“國品認菌2007046靈芝G26”三種。前兩種是由四川野生靈芝馴化而來的，可能屬于G.lu－cidium、G.lingzhi或者四川靈芝；后者源于韓芝×紅芝原生質體融合育成。而文獻中記載的泰山赤靈芝、南韓赤靈芝、日本靈芝、川芝、美國靈芝、鹿茸靈芝等，以及市場上采用的其他靈芝名稱，在分類學上多屬于不規范名稱。這些名稱或命名缺乏專業化、規范化和系統化，且隨意性比較普遍，因此許多靈芝菌種的名稱都有待商榷。隨著靈芝市場的不斷拓展以及野生資源的逐漸匱乏，迫切需要加強對靈芝產業中菌種業的支持，鼓勵靈芝菌種的專利化研究，建立專業化、規范化的靈芝菌種庫，規范靈芝產業的發展，以保護中國靈芝產業的權益。
　　2 靈芝發酵技術
　　發酵技術屬于現代生物技術之一。靈芝發酵技術是指靈芝菌絲細胞在反應器內于最適溫度、pH值、氧氣濃度和碳氮比等可控環境下生長，由于呼吸作用產生的代謝廢氣等得到及時排放，其細胞新陳代謝旺盛，菌絲生長分裂迅速，在短時間內能產生大量的菌絲體或定向目標產物。靈芝含有超過400多種具有生物活性的化合物，其中靈芝多糖和三萜類化合物為主要藥效成分。從這個意義上說，靈芝發酵技術前景廣闊。目前靈芝發酵技術分為兩種，即液體深層發酵技術和固體發酵技術。
　　2.1 液體深層發酵技術
　　林忠平等以靈芝、紫芝等為材料最早進行了靈芝深層培養研究，培養基以花生餅粉和蔗糖為主，所得的發酵液和菌絲體用于臨床試驗，試驗證明靈芝發酵產物有與靈芝子實體相似的療效。由于液體深層發酵技術具有生產周期短、產物易控制、利于工業化、提取成分容易等特點，與人工栽培技術相比有明顯優勢，具有廣闊的應用前景。
　　靈芝菌種、培養基組分、發酵參數等是影響靈芝液體深層發酵的重要因素。從自然界分離出的靈芝菌，依靠自身代謝調節系統，趨向于平衡生長和繁殖，生長速度慢，生產能力低，不能滿足液體深層發酵對大規模靈芝生產菌種的要求。目前，靈芝菌種的選育主要采取對孢子、原生質體等進行誘變育種。李剛等對靈芝菌株進行原生質體紫外誘變育種，成功得到2株多糖含量和產量明顯高于原始菌株的誘變株。朱芬等在對供試靈芝菌株進行原生質體紫外誘變的基礎上，經過多重篩選試驗，獲得了菌絲干重和三萜含量穩定提高的誘變株UV-3。液體發酵培養基主要由碳源、氮源、無機鹽和生長因子等組成。其中，碳源主要有葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、玉米粉等；氮源有酵母粉、蛋白胨、玉米漿、豆餅粉、麩皮等；適當的碳氮比和pH值對靈芝菌絲體發酵及多糖含量均有重要意義。發酵參數要根據實際生產需要進行選擇和控制，主要控制參數包括培養溫度、pH值、培養時間、種齡、接種量、振蕩頻率、轉速及溶氧量等。孫金旭等以菌體量、胞外多糖產量為目標，利用正交試驗優化了靈芝真菌發酵條件，最佳條件是轉速200r·min-1、接種量15%、通氣量200L·h-1，菌絲體最大產量可達7.35g·L-1，胞外多糖干重最高產量可達0.92g·L-1，菌絲體產量與胞外多糖產量存在線性關系。
　　利用靈芝發酵技術獲得的菌絲體或者發酵產物，所含有的營養成分和特殊成分含量、療效和保健功效等均與子實體相似，有些特殊成分的含量還遠高于子實體。從靈芝深層發酵產物中可以提取許多有用的藥物、生化產品以及生理活性物質，如多糖、多肽、生物堿、萜類化合物、甾醇等。
　　2.2 固體發酵技術
　　由于在研究食（藥）用菌次生代謝產物的過程中，過分重視液體培養，忽視了固體發酵生產，對靈芝固體發酵的研究較少。靈芝固體發酵的培養方法分為非谷物性培養料固體法和谷物性培養料固體法。谷物性培養料固體法多采用小麥、玉米等為發酵基質。高文庚等利用玉米、小麥、大豆作為發酵基質，接入靈芝液體菌種，經固體發酵獲得的菌質營養成分得到提高。20世紀90年代，一些學者注意到開展中藥微生物轉化研究的巨大價值并付諸實踐，由此，新型（雙向性）固體發酵為靈芝藥用價值的開發拓展了廣闊空間。以單一或復合中藥材為藥性基質發酵靈芝或靈芝與其他真菌的復合菌種，將形成大量不同的發酵組合，從而產生無限量的成分與性質不同的“藥性菌質”。鄭林用等用靈芝與丹參雙向固體發酵形成藥性菌質，治療血瘀模型小鼠效果顯著。徐淑蓓等研究發現紅曲霉與鹿角靈芝復合發酵后，靈芝多糖產量增加15%；紅茶菌復合菌株則對靈芝發酵中菌絲體總量及胞外多糖的產生有競爭抑制作用。
　　靈芝固體發酵技術與子實體栽培相比具有難度低、生產周期短、規模可大可小、同等設備產出量高的優點；與液體發酵相比又具有投資少、占地少、設備和工藝簡單、風險小、產品無異味、次生代謝產物積累時間長和培養料來源廣泛等優點[3]。靈芝固體發酵產物可以利用溶劑提取其中的有用成分，再將提取物制成飲料、調味品、保健品和藥物等，也可以直接制成片劑、膠囊、沖劑、食品添加劑和飼料等。
　　3 靈芝栽培技術
　　受中國傳統消費習慣的影響，靈芝子實體（干重、鮮品）在數量上仍是我國靈芝市場的主要產品，主要由人工栽培獲得。通過人工栽培，同時還可獲得孢子粉及以孢子粉為原料的孢子油等。因此，靈芝栽培技術是目前我國靈芝生產的最主要技術之一。靈芝的栽培方式從栽培原料上可分為段木栽培和代料栽培。
　　3.1 靈芝段木栽培
　　靈芝段木栽培多選用闊葉樹種，多數闊葉樹種均可用于靈芝栽培，如柞、櫟、栗、榆、樺等材質堅硬、樹皮較厚的硬雜木。其中，尤以殼斗科柞木最佳。目前市場上有經銷商專門選購段木靈芝，樹木資源豐富的地區可采用段木栽培法。如東北地區可采用蒙古櫟（柞木）（QucrcusmongolicaFisch）、槲樹（菠蘿葉）（QuercusdentataThunb）等樹種作菌材。用于段木栽培的靈芝品種主要是赤靈芝和紫芝，但以南韓靈芝1號、2號，泰山靈芝1號、2號，圓芝6號較為理想，表現為蓋大，肉厚，色澤光亮，產量較高等特點。段木栽培又分為長段木生料栽培、短段木生料栽培、短段木熟料栽培、樹樁栽培以及枝束栽培等。隨著靈芝產業的發展和生產工藝的不斷完善，栽培方法各地不盡相同，主要包括袋的大小、段木長短、接種方法、埋土方式等，各地可選擇適合自己的栽培方法進行栽培。
　　靈芝段木栽培技術含量低、取材方便、產量高、質量好，是最接近野生靈芝的栽培方法，但成本高，生長周期長，生物轉化率低，勞動強度大，易受季節、環境、區域、原料等因素的制約，產品品質難以控制，對林業也有一定的破壞。
　　3.2 靈芝代料栽培
　　靈芝代料栽培主要以闊葉樹雜木屑或棉籽殼為基本主料，輔以麥麩、米糠和玉米粉等，常用的化學添加劑有石膏粉、碳酸鈣和磷酸二氫鉀等。栽培基質要求潔凈、無蟲、無毒、無異味。常用配方有：木屑80%、麥麩17%、石灰1%、草木灰1%、蔗糖1%；棉籽殼70%、玉米粉23%、麩皮5%、石膏1%、石灰0.5%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.2%；棉籽殼55%、木屑40%、麩皮5%、石膏1%、蔗糖0.5%，水65%。培養料配好后要拌均勻，含水量一般控制在60%～65%，以用手抓緊時指縫有水溢出但不滴下為宜。靈芝代料栽培已在靈芝產業中得到廣泛應用。
　　以茶枝屑、枇杷枝屑、芒果木屑、桑枝屑、椰子果皮、核桃殼、薏苡秸稈等為代料也可栽培靈芝。王沖等利用茶枝代替靈芝栽培料中的木屑，在常規栽培料中加入不同比例的茶枝進行對比試驗，篩選出1個較優配方（茶枝70%、木屑10%、麥麩13%、玉米芯5%、石膏粉1%、過磷酸鈣1%）。使用該配方比常規栽培料栽培出的靈芝，其多糖含量更高。例如貴州省、福建省等茶產業比較多的地區，可以采用以茶枝屑代替闊葉樹雜木屑的方法來栽培靈芝，可實現廢棄茶枝的有效生物轉化和循環利用。張平等開展了以枇杷枝屑為主培養料進行代料栽培靈芝試驗，比較了10個靈芝菌株菌絲和子實體生長狀況及生物學效率等指標，篩選出圓芝8號和大紅芝2號兩個適于枇杷枝屑代料栽培的菌株。陳繼敏等利用美國大靈芝菌株篩選出最適的芒果木屑代料栽培基質配方（芒果木屑69%、棉籽殼10%、麥麩20%、硫酸鈣1%，培養基含水量60%，芒果木屑粉碎直徑≤5mm的顆粒），確定了具有珠海特色的代料栽培基質配方。目前經過驗證的適于桑枝栽培的靈芝品種比較多，主要有廣東農業科學院蠶業研究所栽培的優選3號、優選6號、紅芝1號、紅芝2號、南韓紅芝，以及鄒丹蓉等栽培的密紋靈芝、蔡愛群等栽培的松杉靈芝等。另外，馬紅梅、陳亮、魏翱等還開發了用椰子果皮、核桃殼、薏苡秸稈為原料栽培靈芝，并取得了一定的成效。
　　以菌草作為主料可栽培鹿角靈芝及部分赤靈芝，如赤芝G10021、Ga0801和泰山靈芝G10014。用于靈芝栽培的菌草培養基配方主要有：芒萁48%、五節芒35%、麩皮15%、石膏粉2%；芒萁30%、五節芒43%、麩皮25%、CaSO42%。董曉娜等利用巨菌草為原料進行靈芝栽培試驗，篩選出菌草栽培靈芝的最佳配方（菌草含量為48%時為最優配方：巨菌草48%、木屑48%、石灰2%、白糖2%），用此配方栽培海南靈芝，菌絲生長速度快，滿袋時間較木屑培養料縮短，可縮短整個生產周期。靈芝代料栽培省事、省力、省地，不僅可以保護林木，而且具有生產周期短、生物學效率高、原材料來源廣泛、便于工廠化生產等優點。但代料栽培配方各異，產量差異較大。今后靈芝代料栽培應趨向于規范化、工廠化栽培，最終實現靈芝的GAP生產。
　　4 靈芝GAP生產
　　GAP（goodagriculturepractice）即良好農業規范，是關于藥用植物和動物規范化農業實施的指導方針。它包括基地選擇、種質優選、栽種及飼養管理、病蟲害防治、采收加工、包裝運輸與貯藏、質量控制、人員和設備管理、文件管理等各個環節。近年來，靈芝人工栽培技術日漸成熟，在很多地方已頗具規模，并已逐步形成靈芝規范化種植基地。但也存在著許多問題，如靈芝種質不清，品種混雜；靈芝栽培、采收加工技術不規范；部分靈芝有害重金屬及微生物含量超標；部分靈芝質量不穩定或低劣，無國際認可的靈芝質量標準；缺少龍頭企業，盲目跟風種植，抵御風險的能力差；缺乏品牌意識；資金投入不足，綜合研究工作滯后。這些問題明顯制約了靈芝產業的發展，需要通過積極推進實施靈芝GAP生產，從源頭改變落后、分散的靈芝種植和采集形式，建立規范化、現代化的靈芝生產技術，確保靈芝產品質量的“安全、優質、穩定、可控”，保證中國的靈芝產業在國際市場上占有一席之地。
　　靈芝栽培過程中的培養介質、添加的輔料、水源條件、土壤環境、大氣環境和農藥等化學投入品的使用管理等是靈芝GAP生產最先考慮的因素。林樹錢等對靈芝GAP有機栽培進行了研究，證實靈芝GAP種植基地的水源、土壤環境和大氣環境等對靈芝藥材品質有重要影響。食用菌質量責任追溯制度是食用菌GAP生產的核心內容之一，追溯制度的核心是建立食用菌生產檔案制度，包括商標和各種標志的規范使用，以及產品的標識問題等，這些也是我國亟待強化的領域。靈芝GAP生產是占領未來中藥材產業乃至綠色農業的重要制高點，是靈芝產業實現現代化、國際化的先決條件和必要條件，發展靈芝GAP基地是靈芝產業的必由之路。
　　5 小結
　　中國是世界靈芝的物種多樣性中心，這為中國靈芝產業的健康發展提供了強有力的種質資源基礎。因此，加強靈芝種質資源的收集及其開發利用研究非常重要。
　　目前，靈芝生產技術以人工栽培技術為主，其產量早已超過野生靈芝，為目前靈芝市場提供了豐富的原材料，以靈芝人工栽培技術為基礎的靈芝產品包括靈芝藥品（膠囊劑、酊劑、片劑、顆粒劑、口服液）、靈芝保健酒、靈芝保健飲料、靈芝保健食品、靈芝美容品等。目前的靈芝產品無論在科技含量、產品質量以及生產規模上都遠未達到開發目標及消費者需求。因此，必須加強靈芝栽培產品、發酵產品和固體菌質產品中活性成分提取、檢測方法等的研究，采用現代工藝、技術，對靈芝的種植、加工、產品質量等進行標準化、規模化改造，建立完整的靈芝GAP生產技術規范，促進靈芝產業健康有序發展。