在堆料發酵過程中，起作用的微生物主要是嗜溫細菌、放線菌，有時還有嗜溫霉菌。這些微生物自然存在于堆料的原材料中，在合適的條件下生長繁殖，分解利用堆料中的可溶性營養物，進行生物代謝而產生熱量、水和二氧化碳，同時也把氨態氮轉化為蛋白質化合物，多種微生物的增殖和演替使堆料形成了腐殖質，從而具備了獨特的選擇性，這是蘑菇增產的物質基礎。
大部分微生物的生長適溫是20～40℃，稱為好嗜中溫菌（Mesophile）；適宜在40～65℃生長的微生物為嗜熱菌(Thermophile)；適宜在20℃以下生長的微生物為嗜冷菌(psychrophile)。
在蘑菇堆料發酵過程中，主要是嗜熱菌起作用，因此須按嗜熱菌的環境溫度進行調控。
由于大堆的堆料有聚熱效應，發酵產生的熱能使料溫逐漸上升。當溫度升到一定的高度，如40℃對于較先繁殖的好嗜中溫菌群來說已經不適而衰亡，然后由嗜熱菌群取代，直至溫度到達60～63℃。高于這個溫度，嗜熱菌群都不能存活而停止繁殖。但某些嗜熱菌芽孢可以在更高溫度下存活。
堆料中的細菌、放線菌、霉菌等微生物群是如何繁衍交替的？這是非常復雜的問題，要搞清楚并非易事。但根據已有的研究結果可以肯定，在堆料發酵過程中主要有細菌、放線菌、霉菌三種微生物群參與(表6)。
表6 堆料發酵過程中重要的菌群
微生物群 種 屬 名
細 菌 膠粘桿菌 Bacillus coagulans
枯草桿菌 Bacillus subtilis
放線菌 高溫放線菌 Thermoactinomyces sp
高溫單孢菌 Thermomonospora sp
鏈霉菌 Streptomyces sp
霉 菌 灰腐質霉高溫變種 Humicola grisea var.thermoidea
柔毛腐質霉 Humicola lanuginosa
高溫毛殼霉 Chaetomium thermophile var.dissitum
高溫色串孢 Torula thermophile
細菌存在于秸稈莖葉表面，1g干稻草附有高溫細菌1×105個。畜糞中發現有8種以上形態特征不同的球菌與桿菌，1g干糞含菌數量高達1～3×108個。此外，糞草原材料中還含有大量放線菌。Eicker(1980)從發酵堆料中分離出44種中溫菌，50%以上有分解纖維素的能力。
堆料發酵開始時檢出的主要是嗜中溫菌如曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)，這些菌群在之后的二次發酵“巴氏滅菌”過程中基本被消滅，因而在二次發酵后期檢出的主要是嗜高溫菌。一般情況下，二次發酵時堆料的腐熟溫度限定在45～53℃范圍內較適當，這是嗜高溫放線菌和嗜高溫細菌共同的適宜生長溫區。發酵較好的堆料中有無數的放線菌而呈灰白色，即“白化現象”。
荷蘭造料側重于微生物的作用，注重微生物動力學過程。從一次發酵到二次發酵結束，堆肥內微生物群落變化是有序的、可控的。二次發酵重點培養鏈霉菌、雙岐菌和黑腐質霉，這些菌群對蘑菇產量是有益的。不同的生產時期，堆料中的放線菌種類及數量有區別，數據列于表7。
表7 堆料中的放線菌種類與數量
孢子數/克干料重×104
放線菌種類
建堆時 二次發酵 接種時 發菌期 覆土時
普通高溫放線菌
Thermoactinomyces 7.8 16.5 4.7 13.1 --
Vulgaris
高溫單孢菌/放線雙歧菌
Thermomonospora/ 15.2 54.4 48.1 7.0 --
ActinObifida
綠色糖單孢
Saccharomonospora 0.8 0.4 4.3 -- --
Viridis
產褐放線雙歧菌 14.4 60.5 72.4 72.3 4.3
Actinbifida chromogena
(灰色)鏈霉菌 15.5 24.3 24.7 7.0 1.3
Streptomyces spp (grey)
白色鏈霉菌 S. Albus 1.8 -- -- 0.9 --
灰鏈霉菌 S.griseus 1.8 -- 3.9 -- --
諾卡氏菌 Nocardia spp 6.4 5.6 0.1 7.0 2.2
糞生微多孢菌 -- -- 0.2 -- --
Micropolyspora faeni
其它 4.2 9.9 17.1 34.9 2.9
在堆料發酵中繁殖最快的是普通嗜高溫放線菌，在其作用下秸稈的纖維迅速崩解；而綠色糖單孢菌分解木聚糖。
通過發酵積累在堆料中的菌體蛋白質是蘑菇菌絲的優良營養源。接種蘑菇菌種時，堆料中微生物菌體量(生物量)相當于1克干堆料含9.2毫克。據報道，放線菌和細菌的比例是2.8:1，細菌總數是1克干堆料1×1011個，1克干堆料中菌類細胞的排列總長度可達39.5公里。據Sparling GP（1982）報道，堆料中的微生物生物量為堆料干重的2%。
試驗表明，堆料中添加蔗糖和糖蜜等可溶性糖類，可使高溫細菌明顯地增殖，堆料可在較短時間內發酵結束而不含游離氨，干物質的損失變少，蘑菇的產量增加。
